PBMC重编程全攻略:5天预处理+仙台病毒高效诱导
对于许多疾病研究和临床治疗而言,诱导多能干细胞(iPSC)打开了通往个性化医疗的大门。但传统从皮肤成纤维细胞获取iPSC的方式,却面临着一个现实困境:患者往往不愿接受侵入性的皮肤活检。
外周血单核细胞(PBMC)成为突破这一困境的理想选择——仅需10mL外周血,就能通过非整合重编程技术获得临床级iPSC。最新发表于《Advanced Science》的研究揭示:优化细胞周期调控可使重编程效率提升2倍以上。因此,PBMC重编程已跃升为iPSC制备的“黄金捷径”。
赛业生物拥有先进的体细胞重编程技术,可通过血液收集体细胞样本进行重编程,产生高质量的人iPSC细胞,成功率高达99%。我们采用稳定的附加型质粒重编程方法,非整合,不影响下游实验;同时具有标准化操作流程兼容多种培养体系,可大规模生产高纯度细胞。
本文我们将手把手拆解教学:“一滴外周血,三周干细胞”——无需皮肤活检的iPSC制备方案,及效率提升经验分享。
01 为什么选择PBMC作为重编程起点?
PBMC作为外周血中的免疫细胞群,包括淋巴细胞和单核细胞,已成为最常用的iPSC来源之一。相比成纤维细胞,PBMC具有三大不可替代优势:
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微创获取:仅需常规静脉采血10mL,患者接受度高。
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增殖能力强:CD34⁺造血祖细胞重编程效率可达1%,远高于成纤维细胞的0.01%。
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临床应用广:易实现自体移植,规避免疫排斥风险。
在2015年有研究团队通过仙台病毒的方法,率先建立PBMC非整合重编程体系,获得的iPSC经多能性验证核型正常且无外源基因残留,为疾病建模铺平道路。
02 PBMC分离与预处理核心要点
供血要求与分离步骤
采血管选择:抗凝管直接采集静脉血。
分离流程:
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血液以PBS按1:1~1:4稀释(提高单核细胞纯度)。
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叠加于Ficoll密度梯度液上。
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750×g离心30min(关闭离心机制动)。
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吸取白膜层(PBMC富集层)。
预处理关键(-5天至0天)
分离后的PBMC需经5天活化培养以提升重编程敏感性:
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接种密度:1×10⁶细胞/孔(24孔板)。
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培养基:红系扩增培养基或者CD34+扩增培养基。
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第3-4天补液:添加0.5mL新鲜培养基(勿扰动贴壁细胞)。
避坑提示:
使用超过5天的陈旧PBMC或传代次数超过3次的细胞,重编程效率将显著下降(表观遗传记忆增强)。
03 仙台病毒重编程标准化流程解析
病毒载体选择与感染参数
载体类型 |
整合风险 |
清除时间 |
适用场景 |
仙台病毒 |
无 |
28天内清除 |
临床级iPSC构建 |
附加体载体 |
极低 |
不定 |
基础研究 |
mRNA转染 |
无 |
72小时降解 |
GMP生产(成本高) |
转导操作流程(第0天)
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细胞准备:收获3×10⁵ PBMC,500×g离心5min。
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病毒混合:四因子仙台病毒(Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc),MOI设置:血细胞MOI=10(需添加Polybrene增强感染)。
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离心强化:1000×g离心30min(30℃)→ 提升病毒感染效率40%。
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孵育条件:37℃、5% CO₂过夜。
Day 1-3:启动期
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玻连蛋白包被培养板(5μg/mL PBS溶液预处理1小时)。
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离心法转移细胞:1000×g离心10min。
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培养基切换:改用iPSC专用培养基(如赛业OriCell®自研专用完培,货号HUIPS-90011)。
Day 4-14:多能性激活
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每日换液:清除未贴壁细胞。
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第7-10天:出现典型iPSC克隆(边界清晰、核质比高)。
Day 15-21:克隆挑取
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机械法挑取:使用25号针头分离克隆(避免酶消化引入动物源成分)。
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扩增培养:添加10μM Y27632(Rho激酶抑制剂)抑制凋亡。
分子与功能验证
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多能性标志物:Tra-1-81/SSEA4免疫荧光染色阳性率>90%。
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三胚层分化能力:外胚层、中胚层、内胚层。
安全性验证
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核型分析:G显带确认染色体稳定性(重点关注1/12/17号染色体易位)。
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残留病毒检测:RT-PCR检测SeV基因组。
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阴性标准:传代至P10后病毒完全清除。
离心强化技术的优化参数
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双重离心法:病毒转导时离心(1000×g,30min)+细胞转移时离心(1000×g,10min)。
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效率提升:悬浮细胞损失减少60%,克隆形成率提高至15%。
从科研到临床,PBMC来源的iPSC正成为疾病建模与细胞治疗的新支柱。随着非病毒递送技术(如Nucleofector™电转)的成熟,以及细胞周期调控策略的应用,重编程过程正变得更安全、快速。
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赛业生物iPSC一站式体外技术服务平台,拥有成熟的重编程、基因编辑和体外分化技术,同时结合一站式表型分析服务,可为客户提供从疾病模型构建到检测的全流程解决方案,助力多种疾病应用场景的高效研究与开发。
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