PBMC作为外周血中的免疫细胞群，包括淋巴细胞和单核细胞，已成为最常用的iPSC来源之一。相比成纤维细胞，PBMC具有三大不可替代优势：

在2015年有研究团队通过仙台病毒的方法，率先建立PBMC非整合重编程体系，获得的iPSC经多能性验证核型正常且无外源基因残留，为疾病建模铺平道路。

• 血液以PBS按1：1~1：4稀释（提高单核细胞纯度）。

• 叠加于Ficoll密度梯度液上。

• 750×g离心30min（关闭离心机制动）。

• 吸取白膜层（PBMC富集层）。

• 接种密度：1×10⁶细胞/孔（24孔板）。

• 培养基：红系扩增培养基或者CD34⁺扩增培养基。

• 第3-4天补液：添加0.5mL新鲜培养基（勿扰动贴壁细胞）。

1. 细胞准备：收获3×10⁵ PBMC，500×g离心5min。

2. 病毒混合：四因子仙台病毒（Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc），MOI设置：血细胞MOI=10（需添加Polybrene增强感染）。

3. 离心强化：1000×g离心30min（30℃）→ 提升病毒感染效率40%。

4. 孵育条件：37℃、5% CO₂过夜。

• 玻连蛋白包被培养板（5μg/mL PBS溶液预处理1小时）。

• 离心法转移细胞：1000×g离心10min。

• 培养基切换：改用iPSC专用培养基（如赛业OriCell^®自研专用完培，货号HUIPS-90011）。

• 每日换液：清除未贴壁细胞。

• 第7-10天：出现典型iPSC克隆（边界清晰、核质比高）。

• 机械法挑取：使用25号针头分离克隆（避免酶消化引入动物源成分）。

• 扩增培养：添加10μM Y27632（Rho激酶抑制剂）抑制凋亡。

04 三重验证确保iPSC质量

• 多能性标志物：Tra-1-81/SSEA4免疫荧光染色阳性率>90%。

• 三胚层分化能力：外胚层、中胚层、内胚层。

• 核型分析：G显带确认染色体稳定性（重点关注1/12/17号染色体易位）。

• 残留病毒检测：RT-PCR检测SeV基因组。

• 阴性标准：传代至P10后病毒完全清除。

05 前沿加速策略：从三周缩短至七天

• 双重离心法：病毒转导时离心（1000×g，30min）+细胞转移时离心（1000×g，10min）。

• 效率提升：悬浮细胞损失减少60%，克隆形成率提高至15%。