间充质基质细胞（MSC）近年来被广泛应用在再生医学领域，可促进各种结缔组织的再生。大量证据表明，移植的MSC通过分泌生长因子、细胞因子和细胞外囊泡来广泛促进组织再生。与单个分散细胞相比，MSC在聚集成球状体后可分泌更高浓度的因子，从而进一步提高了组织的再生潜能。

然而，尽管MSC球状体拥有良好的治疗前景，但它们在体内的存活率却很低，且由于降解和扩散，这些生物活性因子只能短暂存在于特定的伤口部位。为了解决这个问题，加州大学戴维斯分校（UC Davis）的研究人员合成了一种硫酸化海藻酸盐水凝胶平台，希望通过封住MSC球状体分泌的因子来增强组织再生。

该研究发现，MSC球状体与硫酸化海藻酸盐的结合使用可促进肌肉再生。这项研究成果于2023年1月1日发表在《Acta Biomaterialia》杂志上，有望应用于肌肉损伤的修复。

研究材料与方法

在这项研究中，SD大鼠骨髓来源的MSC购自赛业OriCell^®，研究人员在细胞传代后将其培养成MSC球状体，并转移到海藻酸盐溶液中，交联形成水凝胶。他们在研究中使用了SD大鼠的比目鱼肌挤压伤模型。他们使用偏振光显微镜分析了胶原蛋白质量和组成，并采用羟脯氨酸含量分析来测定胶原蛋白溶解度。

技术路线

研究人员发现，当MSC球状体被包裹在硫酸化海藻酸盐水凝胶中时，生物活性生长因子的保留时间延长，有助于血管内皮形成和成肌细胞侵袭。于是，他们将这种水凝胶（sulfated）植入大鼠比目鱼肌挤压伤模型中，以评估其治疗潜力。对照组包括非硫酸化的水凝胶（non-sulfated）和无细胞的硫酸化水凝胶（sulfated acellular）。

植入后六周，近红外成像结果显示，硫酸化和非硫酸化水凝胶中的MSC水平相似（图1），说明硫酸化不影响球状体的生存能力。与对照组相比，包含MSC球状体的组表现出更厚且更深色的肌肉。组织H&E成像结果显示，水凝胶植入两周后各个组中会出现纤维化组织。与非硫酸化组相比，硫酸化组的纤维化组织在六周时有所减少，表明硫酸化处理导致更有组织的肌肉再生。

硫酸化不影响MSC的生存能力^[1]

在肌肉再生过程中，一种常见的失调是形成纤维化的瘢痕组织，其主要由胶原蛋白组成，会严重限制肌肉的活动能力。于是，研究人员对上述肌肉组织中的总体胶原蛋白水平和不溶性胶原蛋白比例进行了量化，以便确认纤维化反应。结果显示，与其他组相比，硫酸化MSC球状体处理引起的过剩胶原蛋白较少，说明它并没有诱发严重的纤维化反应。在进一步分析胶原蛋白的组成后，研究人员确认硫酸化球状体组诱导的胶原蛋白沉积量较低，胶原蛋白压实程度与未受伤的肌肉更相似。

之后，研究人员评估了水凝胶处理对神经支配和血管形成的影响。在水凝胶植入六周后，通过对乙酰胆碱受体进行染色，经硫酸化球状体处理的损伤显示出更多的神经肌肉接头。再通过对血管标志物CD31的免疫组化染色，他们发现随着球状体的加入，阳性染色呈现增加的趋势（图2）。这些数据表明，硫酸化球状体组显著改善了神经肌肉接头的生成，促进了新血管的形成，并在两周后产生了更多成熟的肌纤维，表明这是一个有利于神经支配和血管形成的环境。

图2. 包含球状体的硫酸化水凝胶促进了血管形成和神经支配^[1]

研究人员还发现，六周后再生的肌肉在物理和机械特性上都与对侧对照肌肉相当。硫酸化水凝胶的加入引起肌肉弹性增加，在20%应变下的被动动态应力明显下降。运动范围分析显示，六周时的运动范围与对侧对照组相似。这些数据表明，在植入水凝胶六周后，损伤组织在被动物理特征方面都接近完全再生。

为了进一步分析再生肌纤维的成熟度，研究人员还通过RT-PCR测定了常见的肌源性分化标志物的表达。在损伤后两周，硫酸化水凝胶中MSC球状体的处理导致肌肉分化标志物Myog的表达增加。不过在六周时，各组之间的成熟肌肉形成标志物Myh2表达相似。他们认为，硫酸化水凝胶的处理加速了肌纤维的成熟，但由于自然修复机制的作用，若评估的时间点较晚，其效果就会减弱。

结论

这项研究采用一系列分析技术评估了硫酸化海藻酸盐材料修复大鼠比目鱼肌挤压伤的能力（图3）。研究发现，硫酸化海藻酸盐与MSC球状体的组合减少了胶原蛋白沉积，改善了肌源性分化标志物表达，并增加了神经肌肉接头，表明这种方法有望促进肌肉再生并减少纤维化。

原文检索

[1]M.A. Gionet-Gonzales, R.C.H. Gresham, K.H. Griffin et al., Mesenchymal stromal cell spheroids in sulfated alginate enhance muscle regeneration, Acta Biomaterialia, https://doi.org/10.1016/j.actbio.2022.10.054