经典实用的冻存保护剂DMSO，我猜你一定用过
二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），相信很多科研小主都对它略有耳闻，不少试剂厂家也会特别提醒其产品中含有这个成分。那么，DMSO在细胞培养中有什么作用？为何我们离不开它，却又畏惧它？且听本回分晓。
DMSO：“我是一块砖，哪里需要哪里搬”
物理性质:常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性很强的可燃液体，相对密度为1.095-1.105g/mL[1]
化学性质:分子式为C2H6OS，结构简式（CH3）2SO，大部分的水溶性化合物和脂溶性化合物都可被其溶解，俗称“万能溶剂”
DMSO物化性质
DMSO在上世纪五十年代被发现，历经了几十年的发展，是目前最为广泛使用的亚砜之一。按照应用需求不同，DMSO可分为外用药级、工业级、药用级、试剂级、电子级等，它的身影遍布各处，“万能溶剂”的适配度真绝了。
医药合成反应溶剂；农药用溶剂；染料、颜料用溶剂；石油萃取溶剂；防锈剂；聚合物的制作、浸渍；合成树脂聚合反应溶剂；水热合成溶剂；冻存保护剂；透皮促进剂......
此外，我国还是DMSO生产和出口大国，随着它的应用领域的不断扩大，发展前景可观。
DMSO：一毒百害？我有话要说
DMSO是实验室经常使用的试剂，提起它，常常与“毒性”一词挂钩，但它对细胞生物学及患者的毒性影响一直是个持续争议的话题。
在体外细胞培养实验中，常常会冻存一部分细胞，将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存。细胞在不加任何保护剂的情况下冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶从而造成细胞膜破裂等损伤，故需要加上DMSO、甘油类的冻存保护剂。最常见的用于哺乳动物细胞和组织的冷冻保护剂是DMSO。然而，高浓度的冷冻保护剂（如DMSO、乙二醇和高分子量试剂）可能对细胞有毒。
深低温保存过程中细胞损伤的潜在机制[2]
实践发现，DMSO在某些浓度下对细胞是有毒的，也有可能是其他原因。早在1990年，研究发现DMSO在室温中对细胞的毒性作用比在4℃时大；经10%DMSO低温保存的骨髓和胎肝细胞，用稀释而不洗脱DMSO的方法输注给患者时，剂量在0.92g/kg体重，临床应用安全。[3] DMSO的毒副作用还在持续探讨中，使用不当可能会改变细胞的多能性和遗传学特征，移植后的细胞可能会发生不良反应。所以，亟需对于临床应用的细胞冻存尽量减少DMSO的用量，或替换使用更安全的冷冻保护剂。
因此，有研究人员制定了冷冻保护剂使用的“3Rs”法则，即采用“去除、减少、替换”关键手段，以减轻DMSO潜在毒性作用。
去除：在解冻的细胞产品中稀释或冲洗
减少：降低DMSO浓度或加入其它冷冻保护剂补充较低浓度的DMSO
替换：开发新冷冻保护剂，考虑适合临床适用
减轻DMSO毒性的“3Rs”法则[4]
有趣的是，在玻璃化过程中使用的一些渗透性冷冻保护剂（如甲酰胺）的毒性可以通过添加DMSO、尿素和乙酰胺等化合物来降低，这种方法被称为冷冻保护剂毒性中和。[2]
DMSO：细胞复苏后该马上去除吗？
既然培养中残余的DMSO是细胞复苏后存在毒性的主因，那么解冻时有必要将其尽快去除吗？
不必。除少数对DMSO特别敏感的细胞外，绝大部分细胞在解冻之后应放入培养基，一种方法是直接加入到培养基，待第二天细胞贴壁后更换新鲜的培养基，以去除DMSO；第二种方法是加入数倍体积的培养基混匀后，低速离心去掉对细胞有毒害作用的DMSO，然后把细胞接种到培养皿中。
拥有好的冻存配方和恰当比例、冻存方法，在细胞的冻存和复苏操作的过程中更要牢记“慢冻快融”法则，以让细胞乖乖冻存。
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参考文献
[1]《中华人民共和国药典》2020年版四部药用辅料
[2] Murray, K.A., Gibson, M.I. Chemical approaches to cryopreservation. Nat Rev Chem 6, 579–593 (2022). https://doi.org/10.1038/s41570-022-00407-4
[3] 刘作斌,徐亦青,张佐云,魏汉东,邢桂春,吴祖泽,金玉米,郑斯涌,江希明.冷冻保护剂二甲基亚砜的毒副作用及应用剂量研究[J].中国人民解放军军医进修学院学报,1990(01):31-34
[4] Awan M, Buriak I, Fleck R, Fuller B, Goltsev A, et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity? Regen Med. 2020 Mar;15(3):1463-1491. doi: 10.2217/rme-2019-0145.
[5] Willhite CC, Katz PI. Toxicology updates. Dimethyl sulfoxide. J Appl Toxicol. 1984 Jun;4(3):155-60. doi: 10.1002/jat.2550040308.
[6] 王洁,郝彩丽,孙红军,张心怡,李红娟.二甲基亚砜毒性研究[J].现代生物医学进展,2014,14(35).
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