常用的外泌体提取与鉴定方法
外泌体是一类直径约为30-150nm的膜囊泡，广泛存在于血液、尿液、唾液、脑脊液和腹腔积液等体液中，它们是细胞间物质交换及信息交流的信使。几乎所有类型的细胞都可以在诸如细胞活化、应激和凋亡等生理或病理条件下释放外泌体。
外泌体拥有广阔的应用前景，成为近年来生命科学研究领域的热点。如何获取纯度高、保持活性的外泌体是研究的基础，那么常见的外泌体提取和鉴定方法有哪些呢？
外泌体提取方法
01.超速离心法
优点：适用从生物体液和培养基中分离外泌体。
缺点：
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对粘性生物流体（如血浆和血清）的提取效率较低。
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需配备超速离心机，包括多个离心步骤，耗时较长。
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需要样本量较大。
外泌体可以在蔗糖密度梯度溶液中富集，这种方法以蔗糖密度梯度超速离心。
优点：可从其他囊泡，颗粒和污染物中分离低密度外泌体。
缺点：对离心时间的灵敏度非常高。难度大，操作比超速离心法复杂，实验成本高。
基于不同孔径的膜分离并提取外泌体。超滤膜用于从蛋白质和其他大分子分离外泌体。
优点：提取的外泌体纯度较高。
缺点：外泌体可以粘附在过滤膜上，可能会使超滤膜堵塞或寿命缩短。此外，由于施加额外的力使分析的液体通过滤膜，外泌体可能会变形或损坏。
基于表面标志物的表达、吸附外泌体。与特异性抗体结合的磁珠用于分离外泌体。
优点：该方法允许分离所有外泌体或选择性亚型外泌体。此外，它还可以用于外泌体蛋白的定性和定量。获得更具有亲和力和特异性的外泌体。
缺点：该方法不适用于大样品量。此外，分离的囊泡可能失去功能活性。
该技术通过膜筛分外泌体和由压力或电泳进行过滤。
优点：相对较短的分离时间，获得高纯度的外泌体。
缺点：分离的外泌体回收率低。
基于凝胶空隙的孔径与样品的分子大小的相对关系从而分离溶质。利用尺寸排除柱含有不同直径纳米孔隙的树脂，较大的囊泡可以快速通过并在空隙体积中洗脱。
优点：防止外泌体生物功能丧失，增强外泌体的自然状态。
缺点：不合适大样本的处理。
目前已经出现了多种方法来实现外泌体的提取分离，市面上也开发了外泌体提取试剂盒，但还没有十全十美的提取方法，大家可以针对样本来源以及下游分析选取最适宜的提取方法。例如，有研究人员通过超速离心法和密度梯度离心法提取小鼠血清中的外泌体，结果显示出超速离心法在纯度和应用前景较密度梯度离心法更好，分布较为平均，结构比较清晰，不会堆叠在一起。【1】
外泌体鉴定方法
主流方法主要通过透射电镜、粒径分析和蛋白标志物检测三项验证。
可以简单直观观察到外泌体的形貌，包括形状、大小和部分结构等，初步判断外泌体提取是否成功以及获得的外泌体质量。电镜下的外泌体通常呈茶托样的圆形或椭圆形。
可以检测外泌体的粒径分布和颗粒浓度。
检测外泌体标志蛋白，从蛋白质层面对外泌体进行鉴定。
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参考资料：
1. 邱山桐，张昊，沈雅丽，等.小鼠血清外泌体不同提取方法的比较[J].试验研究，2021.
2. Exosomes: Isolation and Characterization Methods and Specific Markers.DOI//dx.doi.org/10.13070/mm.en.5.1450
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