钝性剥离脂肪组织，清洗并去除筋膜组织及小血管。将脂肪垫剪碎，转移至15mL离心管中。

加入3~4倍体积的0.1% I型胶原酶溶液，37℃水浴振荡约20min，直至细胞混合物成乳状浓稠液体。期间可吹打脂肪组织，辅助消化。

250×g，4℃，离心5min。注意离心机预冷至4℃。

小心吸去上层油脂，注意不要破坏位于下方的胶状沉淀。加人5mL完全培养基，重悬沉淀，转移到新的离心管中，再次离心5min。

重复洗涤一次，吸去上清。

加入8mL完全培养基重悬沉淀，转移至T25培养瓶中，置于37℃，5% CO₂温箱中。

待细胞贴壁生长48h后首次观察、换液。

换液时通过弃去培养基，从而去除未贴壁的细胞。

以后每两天更换一次培养基，细胞汇合达80%-90%时，0.25%胰蛋白酶消化，按1:2或1:3比例首次传代。