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【实操经验篇】大鼠脂肪间充质干细胞的分离培养

脂肪间充质干细胞(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells, ADSCs)是来源于脂肪组织的干细胞,与其它成体干细胞一样具有自我更新和多向分化的能力。人和鼠的脂肪组织均可用于分离ADSCs,其中鼠脂肪组织通常取自腹股沟处脂肪垫。听说你们都想偷师ADSCs原代取材,那就来安排!

 

材料准备

OriCell®大鼠脂肪间充质干细胞完全培养基(货号:RAXMD-90011)

OriCell®胰蛋白酶细胞消化液(0.25%)(货号:TEDTA-10001)

I型胶原酶溶液

 

实验步骤

  • 10天龄到4周龄大鼠1只,麻醉处死,75%乙醇浸泡消毒3~5min。无菌条件下切开腹股沟皮肤,暴露腹股沟脂肪垫。

  • 钝性剥离脂肪组织,清洗并去除筋膜组织及小血管。将脂肪垫剪碎,转移至15mL离心管中。

  • 加入3~4倍体积的0.1% I型胶原酶溶液,37℃水浴振荡约20min,直至细胞混合物成乳状浓稠液体。期间可吹打脂肪组织,辅助消化。

  • 250×g,4℃,离心5min。注意离心机预冷至4℃。

  • 小心吸去上层油脂,注意不要破坏位于下方的胶状沉淀。加人5mL完全培养基,重悬沉淀,转移到新的离心管中,再次离心5min。

  • 重复洗涤一次,吸去上清。

  • 加入8mL完全培养基重悬沉淀,转移至T25培养瓶中,置于37℃,5% CO2温箱中。

  • 待细胞贴壁生长48h后首次观察、换液。

  • 换液时通过弃去培养基,从而去除未贴壁的细胞。

  • 以后每两天更换一次培养基,细胞汇合达80%-90%时,0.25%胰蛋白酶消化,按1:2或1:3比例首次传代。

注:本方法仅供参考,可根据实验需求或经验做合理调整。

 

小TIPS

  • 取材时应将组织清洗干净,仔细剥离去除血管和筋膜组织。

  • 脂肪组织在剪碎的过程中不能研磨,以免破坏细胞。

  • 消化完后的组织在离心前把离心机预冷,使细胞更好的与油脂分离。

  • 用明胶或者胶原蛋白处理培养皿底壁,有利于细胞的贴壁生长。

 

鉴定

  • 形态学观察:

    原代培养后,传代2-3次,ADSCs呈现单层,梭状或多枝状的细胞形态,其直径在25-30um,待细胞达到汇合时,它们形态上呈纺锤形,类似于成纤维细胞,贴壁较牢固。

  • 微生物:

    常使用培养法和PCR法检测细菌、真菌、支原体。

  • 增殖:

    CCK8生长曲线,计算倍增时间。

  • 标记物检测:

    一般的标准为CD29、CD44、CD73、CD105为阳性(>70%);CD34、CD45、CD11b为阴性(<5%)。

  • 诱导分化实验:

    在特定的诱导条件下,脂肪间充质干细胞可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、上皮细胞、心肌细胞等多种细胞。

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