人成纤维细胞的原代培养方法
皮肤为人体最大的器官,成纤维细胞是皮肤真皮层中主要细胞,而且是人体最容易获得的体细胞。人皮肤成纤维细胞不但能够促进表皮细胞的迁移、增殖和分化,还能分泌大量的胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子,具有强大的自我更新能力,从而修复老化的皮肤。因此,已广泛应用于抗皮肤衰老、整形外科、组织工程皮肤等领域。
下面介绍人成纤维细胞的原代培养方法
材料准备
OriCell®人成纤维细胞(货号HXXFB-00001)
OriCell®人成纤维细胞完全培养基(货号HXXFB-90011,套装内含基础培养基、优级胎牛血清和培养添加物)
实验步骤
- 水浴锅37℃预热。完全培养基温浴到37℃。在15mL离心管中加入5mL以上完全培养基备用。
- 从-80℃冰箱中取出细胞,放入37℃水浴锅中,快速晃动,使冻存液迅速融化。注意融化过程必须晃动冻存管,保证冻存液融化迅速、均匀;且晃动时应避免水没过管盖造成污染;管内冻存液融化至只剩一个约2mm直径的冰晶时,即停止水浴。继续晃动冻存管,至冰晶融化。
- 用75%医用酒精擦拭冻存管外表面。
- 在超净台中打开冻存管,用巴氏吸管或移液枪吸取细胞冻存悬液,转移至先前准备的离心管中。
- 用1mL完全培养基洗涤冻存管1次,收集残留细胞,减少损失。
- 细胞悬液以250×g,离心4min。
- 离心后去除上清。加入2mL完全培养基,轻柔吹打细胞沉淀,充分吹散、混匀。
- 将细胞接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中。加入足量完全培养基,1个T25培养瓶中培养基总量不少于5 mL。
- 摇匀细胞,放入37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中。注意接种2h内不可移动、观察细胞。这会严重影响细胞贴壁,造成状态不佳、细胞聚团、贴壁不均匀等情况。
- 复苏次日,观察细胞状态,并更换新鲜的完全培养基或传代。
- 之后,每2天更换一次完全培养基,直到细胞生长至90%汇合,即需传代。通常OriCell®人成纤维细胞传代比例为1:3,72h内生长至可传代汇合度。请根据细胞实际生长情况调整传代比例。
小TIPS
培养人成纤维细胞对于细胞密度有较高的要求,我们建议有条件且计数效率较高的情况下,进行手工计数,以期获得精准的细胞浓度指导接种;在没有精确计数条件的情况下,按照适宜比例传代是更好的方法。
正常情况下OriCell®人成纤维细胞每代生长时间不超过72h,中途不需要换液。频繁换液会破坏构建起的细胞微环境。
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