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干细胞诱导“出”不来?是谁偷走了我的成功率?!

干细胞诱导分化实验

自我更新能力和多向分化能力是干细胞的两个最基本特征。干细胞诱导分化是干细胞鉴定的主要方法,也是干细胞功能学研究的主要途径。

 

但但但......很多小伙伴做干细胞诱导分化实验总是不理想,如何提高实验成功率?赛业OriCell®整理了干细胞三系分化中常见的“疑难杂症”,请各位迅速对照检查,举一反三!

 

高能预警  马上开始

 

Q1 成骨诱导了21天,为什么还诱导不出来?

干细胞在诱导前的状态、密度和纯度是诱导成骨成功与否的关键因素。干细胞在诱导前状态不好,密度低于70%,纯度不够都有可能使得诱导不成功。

 

建议:

✅ 使用状态良好的,代次较早的细胞来进行成骨诱导。

✅ 可适当延长换液时间,3天换液一次改成4天换液一次。

✅ 适当延长诱导时间。

 

Q2 成骨诱导后期为什么细胞会漂浮起来?

干细胞在成骨诱导过程中还会继续增殖,当细胞增殖到一定程度的时候,单层贴壁细胞就会变得容易回缩脱落。

 

故在成骨诱导前,一般建议使用0.1%明胶对耗材表面处理30min,吸掉明胶后晾干方可接种细胞。当细胞达到70%汇合度时可换成骨诱导液开始进行诱导。

 

Q3 成骨诱导操作要点有哪些?

✅ 细胞包被:诱导之前包被明胶(0.1%的明胶溶液),以防止成骨诱导后期细胞出现成片脱落的现象。    

✅ 诱导起始点:细胞汇合度达到65%-70%时开始换用诱导液。

✅ 分化诱导:诱导2-3天进行换液时动作需轻柔,液体沿6孔板壁加入,防止已形成的钙结节被冲刷掉;建议看到明显钙结节的情况下再染色,不要着急染色。

✅ 细胞固定:时间为30min,不宜太长。

✅ 茜素红染色:时间控制在5min左右,如果染色效果较浅可以适当延长时间。 

 

Q4 成脂诱导21天后进行染色,但染不上色或者染色很浅?

染不上色的原因:

❎ 很有可能是诱导没有成功,看不到明显的脂滴或者看到的是细胞空泡。

❎ 若看到明显的脂滴但是染不上色,有可能是染色液失效。

 

染色很浅的原因:

❎ 染色液失效。

❎ 染色液稀释的比例不对。

 

一般油红O染液产品在2~8℃冰箱保存,染色前按油红O染液:蒸馏水=3:2的比例稀释使用(染色前现配现用),稀释后会有明显沉淀出现。为了更好的实验效果,需要用滤纸过滤或者用离心(250×g,4min)的方法去掉沉淀。

 

Q5 成脂诱导21天后,阳性率很低是什么原因?

干细胞诱导前的状态和纯度对诱导的成功与否至关重要。若干细胞诱导前的状态很差,则诱导不一定成功;若干细胞诱导前纯度不高,则诱导的阳性率会很低,甚至为零。

 

此时,一般建议:

✅ 重新诱导,选择代次较早,状态较好,纯度较高的细胞诱导。

✅ 诱导时间可相对延长;或诱导周期从“A液诱导3天,B液维持1天”改成“A液诱导4天,B液维持1天”。

 

Q6 成脂诱导液A液混合后会出现大块沉淀物?可能有2种产生原因:

▶ 若配套组分加入前未充分溶解,加入后即产生沉淀,建议客户在混合前先水浴溶解,待充分溶解后再混合。

▶ 培养基出现的沉淀物也可能是血清融解过程中所释出的蛋白,属于正常现象。

 

Q7 成脂诱导之后油红染色有很多“渣渣”,能去掉吗?

✅ 高倍镜下观察,选择脂滴大且美观的视野拍照。

✅ 赛业OriCell®提供的油红O染液按比例稀释后,滤纸过滤或者离心取上清染色可有效减少“渣渣”。

 

Q8 成脂诱导操作要点有哪些?

✅ 诱导起始点:细胞汇合度达到100%时开始换用诱导液A液。

✅ 分化诱导:通常情况下是“A液诱导3天,B液维持1天”进行循环诱导。实际操作过程中可以根据细胞状态适当增加或者缩短A液诱导的时间。

✅ 油红O染色:换液动作需轻柔, 最后染色时油红O染液和蒸馏水需要按照3:2比例进行稀释并用中性滤纸过滤之后方可使用。

 

Q9 成软骨诱导操作要点有哪些?

✅ 诱导液准备:赛业OriCell®提供的成软骨诱导液是无血清培养体系,需要在15mL的锥形底离心管中进行诱导。

✅ 细胞密度:诱导终浓度为2.5×105/500µL。

✅ 分化诱导:细胞加入诱导液之后24h之内不要摇动离心管,首次弹起细胞的时间一般是24-48h;之后每两天进行一次换液,每次换液之前需要将细胞团弹起以便与诱导液充分接触;

✅ 诱导评估:细胞团直径增至2mm左右时终止诱导,进行后续的石蜡切片以及阿利新蓝染色鉴定。

 

干细胞诱导分化坡陡坎深,愿各位老师都能顺利越过,取得实验成功。

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