冷冷冷冷！间充质干细胞养不好=更=心=冷=？
近日多地遭遇寒冷暴击！更冷的还有实验室里间充质干细胞培养烦恼的“心寒”：自己培养的细胞不是发生老化，就是细胞的分化潜能丧失，或者细胞形态奇奇怪怪.......而师兄培养的细胞不仅形态依旧漂漂亮亮，还保持了干细胞的各种功能，这简直是在撮心窝子呀！
如果你也在为培养间充质干细胞而烦扰，使用了各种方法也不见效，那么这份经验汇总或许可以帮到你，让你轻轻松松开组会，快快乐乐做实验！
“第一题”
你可能踩的坑
◾ 接种细胞起始浓度太低；
◾ 胰蛋白酶消化过度；
◾ 支原体污染。
解决对策
✅ 尽量使用低代次细胞进行实验；
✅接种浓度：建议2.5~4×104个活细胞/cm2；
✅ 消化时在显微镜下看到大部分细胞变圆变亮，轻轻拍打培养瓶两侧可见大部分细胞脱落，此时立即终止消化；
✅ 定期做支原体检测，排除支原体污染。
“第二题”
你可能踩的坑
◾ 培养箱内无CO2或者箱内温度波动大；
◾ 细胞复苏或冻存时受到损伤；
◾ 细胞培养液渗透压不准确或有毒代谢物堆积；
◾ 细胞污染。
解决对策
✅ 定时维护CO2培养箱；
✅ 实验操作过程中轻柔，不可用力过大，以免使细胞受到机械损伤；
✅ 正确配制培养液，定时更换新鲜培养液；
✅ 注意无菌操作。
“第三题”
你可能踩的坑
这是典型的“过犹不及”。很多人接种时担心摇的次数少会造成细胞分布不均匀，就反复多次地摇，结果细胞全部集中在中间。
解决对策
其实只要把握好幅度和力度，前后、左右交替摇三四次就已经足够了，不论孔板、皿或者培养瓶。对于孔板这样的较小的容器，实际每孔加的培养基总量不会超过2mL，不如直接用合适的移液枪在孔板内吹打之后放平，更能获得良好的效果。
“第四题”
你可能踩的坑
◾ 不恰当的冻存方法；
◾ 冻存时细胞状态和活力不理想；
◾ 不合理的冻存密度。
解决对策
✅ 缓慢冷冻；
✅ 细胞应在生长良好、致密度约为 80-90％、活力达90%以上的状态下冻存；
✅ 冻存时细胞密度少于5×105个活细胞/mL时，很难成功复苏；
✅ 冻存管的盖子一定要拧紧，否则水浴复苏时水会渗入造成污染；
✅ 细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。我们建议在-80℃冰箱中的保存时间不要超过48h。
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