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冷冷冷冷!间充质干细胞养不好=更=心=冷=?

近日多地遭遇寒冷暴击!更冷的还有实验室里间充质干细胞培养烦恼的“心寒”:自己培养的细胞不是发生老化,就是细胞的分化潜能丧失,或者细胞形态奇奇怪怪.......而师兄培养的细胞不仅形态依旧漂漂亮亮,还保持了干细胞的各种功能,这简直是在撮心窝子呀!

 

如果你也在为培养间充质干细胞而烦扰,使用了各种方法也不见效,那么这份经验汇总或许可以帮到你,让你轻轻松松开组会,快快乐乐做实验!

 

“第一题”

培养的间充质干细胞总是生长缓慢?

 

你可能踩的坑

◾ 接种细胞起始浓度太低;

◾ 胰蛋白酶消化过度;

◾ 支原体污染。

 

解决对策

✅ 尽量使用低代次细胞进行实验;

✅接种浓度:建议2.5~4×104个活细胞/cm2;

✅ 消化时在显微镜下看到大部分细胞变圆变亮,轻轻拍打培养瓶两侧可见大部分细胞脱落,此时立即终止消化;

✅ 定期做支原体检测,排除支原体污染。

 

“第二题”

间充质干细胞遭遇“非正常死亡”?

 

你可能踩的坑

◾ 培养箱内无CO2或者箱内温度波动大;

◾ 细胞复苏或冻存时受到损伤;

◾ 细胞培养液渗透压不准确或有毒代谢物堆积;

◾ 细胞污染。

 

解决对策

✅ 定时维护CO2培养箱;

✅ 实验操作过程中轻柔,不可用力过大,以免使细胞受到机械损伤;

✅ 正确配制培养液,定时更换新鲜培养液;

✅ 注意无菌操作。

 

“第三题”

接种培养时孔内细胞中间密两边稀?

 

你可能踩的坑

这是典型的“过犹不及”。很多人接种时担心摇的次数少会造成细胞分布不均匀,就反复多次地摇,结果细胞全部集中在中间。

 

解决对策

其实只要把握好幅度和力度,前后、左右交替摇三四次就已经足够了,不论孔板、皿或者培养瓶。对于孔板这样的较小的容器,实际每孔加的培养基总量不会超过2mL,不如直接用合适的移液枪在孔板内吹打之后放平,更能获得良好的效果。

 

“第四题”

细胞冻存后复苏活率低或复苏失败?

 

你可能踩的坑

◾ 不恰当的冻存方法;

◾ 冻存时细胞状态和活力不理想;

◾ 不合理的冻存密度。

 

解决对策

✅ 缓慢冷冻;

✅ 细胞应在生长良好、致密度约为 80-90%、活力达90%以上的状态下冻存;

✅ 冻存时细胞密度少于5×105个活细胞/mL时,很难成功复苏;

✅ 冻存管的盖子一定要拧紧,否则水浴复苏时水会渗入造成污染;

✅ 细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。我们建议在-80℃冰箱中的保存时间不要超过48h。

 

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