主持人：各位朋友大家好，欢迎大家收看本期“走近细胞”之“基因敲除细胞”。大家都知道CRISPR/Cas9基因编辑是一种非常热门非常火的技术。科学家们寄希望于此技术以解决人类无数种难以攻克的疾病。CRISPR/Cas9基因编辑技术不仅被常用来构建基因敲除小鼠以用于疾病发病机制和药理药效研究，还可用来制备基因敲除细胞以供体外实验研究用。相比成熟的基因敲除动物模型的制备技术，由于细胞种类较多，而且生长习性差异很大，制备基因敲除细胞模型反而更有难度。

今晚本节目首次给大家独家批露如何用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除细胞模型。另外，我们还会有请制作基因敲除细胞的科学家现身说法！

接下来，就让我们先来访问一下科学家实验室冰箱里的那一管质粒……

CRISPR/Cas9：没错，我就是这管质粒，我是CRISPR/Cas9。人称基因编辑小能手，简单是我的小名，高效是我的外号。人见人爱，花见花开，用我发文乐开怀。

主持人：CRISPR/Cas9，你能简单的介绍一下自己吗？

CRISPR/Cas9：我的家乡是细菌与古细菌国，在那里我是国家的护卫，专职应对病毒和质粒的入侵。我有很多病毒和质粒的档案，每当这些坏核酸入侵国家，我就拿着通缉令（crRNA/tracrRNA）去扫描，被我识别到我就将其消灭掉！现在科学家把我改造了放到质粒载体里，然后给我配发一个优化的通缉令，这个通缉令把原有的crRNA/tracrRNA组合在一起变成了sgRNA，识别效果还是杠杠滴。

主持人：你是细菌国的好警察，那能说说你具体是怎么工作的吗？

CRISPR/Cas9：别看我名字这么时髦，其实我是一个刀客，Cas9核酸酶就是我的刀，我每天拿着刀和通缉令去巡逻。SgRNA通缉令上有20个碱基的引导序列用来描述坏核酸的特征。我每次都使用Cas9核酸酶扫描所遇到的核酸序列，我通常先寻找PAM序列（NGG和NAG），如果PAM前方的20个碱基序列恰好和通缉令上的引导序列一致，嘿嘿，就别怪我刀下无情、一刀两段了！

主持人：有意思，那你是怎么从细菌国护卫成为基因编辑能手的呢？

CRISPR/Cas9：我拿着通缉令和剑进入细胞，我做的事情跟在细菌国做的差不多，只是目标变成了基因组DNA。

主持人：这样说来，你就是在基因组上砍了一刀，这似乎跟基因编辑没有关系吧？

主持人把话筒递给细胞：让我们来采访一下基因敲除细胞，了解一下当时的情形。

细胞：CRISPR/Cas9本身并没有直接改变我的基因组DNA序列，他只是在我的基因组DNA上砍了一刀就扬长而去，造成一个双链缺口（Double Strand Breaks)。我是个完美主义细胞，我又怎能容忍缺口这种不完美的事情，所以我会想方设法把它补好。通常我会用NHEJ(Non-homologous end joining）的方式进行随机修补，至于缺口修复后是多了碱基还是少了碱基，我就不管啦！只不过我这次修补刚好是造成了非3倍数的碱基改变，产生了“移码突变”，所以就把那个基因敲除了。

主持人：看来你是个随便的完美主义者，那你知道基因敲入和点突变是怎么实现的吗？

科学家接过话筒：我来补充一下，如果在CRISPR/Cas9造成双链缺口的同时，把包含同源DNA片段的特定序列的修复模板（Donor）图纸一起给细胞，细胞也可能会把缺口修复跟图纸得一模一样，这种修复模式称为HDR(Homology directed repair)，这样子就可以实现基因敲入或者点突变了！

主持人：看来科学家对做基因编辑很有心得呀！请问您基因编辑做的这么好，是有什么秘诀吗？

科学家：秘诀就是专注。我在赛业生物工作十余年了，一直专注于动物和细胞的基因编辑。虽然基因编辑是一项原理听起来很简单的技术，但真正做起来并没有那么容易。我所做的就是日复一日的持续不断的优化方案，优化实验体系，以获得更高的效率，更快的编辑速度，更好的服务客户。

主持人：看来科学家还是蛮有心得的，接下来我们进入广告时间，休息一下吧。

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