刘秀芳 中国科学院深圳先进技术研究院

• 1. 细胞复苏：快/稳/柔
  • 1) 冻存细胞一定要快速转移到37度水浴锅中。
  • 2) 细胞融化后，所有转移过程，需要擦拭管口消毒，垂悬细胞之时，培养基需要贴壁打入，吹打时需要温柔且有力度的吹打。
  • 3) 低倍镜观察细胞密度后，及时转移到培养箱中。复苏24h后，及时更换新鲜预热的培养基。
• 2. 细胞传代：新鲜/均匀/定时
  • 1) 完全培养基不能超过两周，尽量保持现配现用，不要反复预热。
  • 2) 细胞第一次传代时，需要计数，按说明书个数传代，每次传代都需要更换新培养瓶，且转移到瓶子时候，吹打细胞让其均匀铺在细胞瓶表面，切记吹打太多次，对细胞造成二次机械损伤。
  • 3) 细胞传代的周期要固定。
• 3. 细胞冻存：健康/液氮/新鲜
  • 1) 一定要选用健康的细胞，所谓的健康是要在细胞在3-5代以内冻存细胞。
  • 2) 保存细胞的时候，最好置于液氮长时间保存，3个月以内使用可以在-80度保存。
  • 3) 冻存液一定要现配现用或者用新鲜的专用培养基。

宁双成 湖南中医药大学

• 1. 慎防污染
  • 1) 使用细胞房或操作台时疑似污染的离心管、培养瓶、枪头等物品请务必丢弃。
  • 2) 对于培养瓶细胞若出现突然批次性地活性不佳便考虑培养过程哪里出现污染诸如培养液、pbs等就要及时换新。
  • 3) 对于新购或新进的细胞尤其需要注意防止污染带进培养箱等。
• 2. 慎操作
  • 1) 在细胞复苏、换液、传代、冻存等过程中，“温柔”对待细胞，比如复苏时离心将冻存液吸出，复苏后待细胞贴壁后及时换液排除少量冻存液。
  • 2) 传代时同样通过离心与换液排除胰蛋白酶对细胞的损害。
  • 3) 冻存时将冻存管应梯度降温，不能骤降；复苏时温度可37-38摄氏度快速复溶加培养液后离心脱去上清。
• 3. 慎思

  细胞实验不同于其他实验，所有步骤都应慎思而后行，否则将会带来轻则状态不好，重则出现污染等后果，即使出现污染也应该尽快作补救措施或者其他考虑如重新复苏等防止实验进度的耽搁。

• 1. 勤消毒
  • 1) 在细胞房，手但凡要接触培养液、培养瓶或培养箱等都要提前喷酒精消毒，在操作台如若不慎将液体滴在台上也应及时用棉球擦拭，操作台使用前后均用酒精棉球擦拭。
  • 2) 操作台必须提前照紫外灯半小时以上，且维持时间不得超过2-3h，过时请再照台。
• 2. 勤换液、传代与冻存

  勤换液、传代与冻存不仅能保证细胞“肆意”生长的营养条件，有时候还能将污染较小化。

做细胞实验也就半年之久，也是一步步摸爬滚打，非常能理解同行们的苦楚，做细胞实验需要一颗谨慎的心，还有一个勤快的灵魂，祝愿大家能实验顺利！

罗嘉亮 南方医科大学

• 1. 细胞复苏：用大约39℃（比一般37℃稍高）进行水浴摇晃，这样能尽快加速融化，然后能尽快用培养基稀释DMSO 离心沉淀 ：800rpm 5min 低速离心能减少对细胞伤害的同时短时离心能减少DMSO对细胞的毒性，取细胞沉淀置于已加培养基的培养皿中
• 2. 培养：使用含10%血清的全培（血清在分装前放于四度冰箱融化两天，不要直接水浴或放在常温 以减少析出），培养基可加入适量的双抗（能够不加尽量不加 ，尽可能减少细胞培养条件的变量）
• 3. 实验：加抑制剂或药物前一晚，换上基础培养基（能让细胞更好吸收药物）加药物时换回全培
• 4. 传代：用含EDTA的胰酶消化，注意不要消化过度，镜下及时观察细胞形态（可放在孵箱加速消化）
• 5. 冻存：选择细胞密度大约80%-90%时，且生长状况良好的细胞冻存。含细胞的全培：血清：DMSO=5：4：1 放入冻存盒内 -80℃放大约5小时 然后放在液氮罐中 记得做细胞要一丝一苟，不要养成随意的习惯，因为只要中间一步有错就会导致细胞的形态或生长有所变化，对实验产生不可预料的后果。

卢硕 中山大学附属第三医院

• 1. 打开水浴锅，设置好温度，超净台预约好时间，准备相关的实验耗材（含有10%胎牛血清和双抗1640的完全培养基、PBS、离心管、带孔培养瓶、移液枪、胰酶）。
• 2. 将冻存的细胞取出，37℃水浴，不要让水浴锅的水接触到瓶盖与瓶身的连接处，待复苏后，在超净台进行实验；把冻存管的液体加入15ml离心管，再加入2ml完全培养基，配平，1000rpm×3min离心，弃上清，加入1ml完全培养基重悬后加入25ml培养瓶中，再加入4ml完全培养基，盖好瓶盖，“十”字摇匀，避免培养基接触瓶口，在瓶身上标记好细胞名词、时间、实验人员名称。
• 3. 放入37℃、CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养；定期观察细胞的情况，并做好记录；
• 4. 待培养瓶中细胞汇合度为80~90%时，进行传代。弃旧培养基，加入2mlPBS，轻微摇晃瓶身后弃PBS，加入1ml胰酶后将培养瓶放入细胞培养箱中孵育2min。
• 5. 时间结束后取出，立即放置在倒置显微镜下观看，细胞皱缩成球形或部分脱离瓶底代表消化已基本完成。
• 6. 立即培养瓶中加入2ml完全培养基以终止消化，吸取瓶中的培养基吹打瓶璧，使余下的细胞吹至培养基中。
• 7. 将得到的细胞悬液转移至15ml离心管中，做好标记，1000rpm×3min离心。
• 8. 弃上清，向离心管中加入2ml培养基，吹打使细胞重悬分散，在新旧的培养瓶中分别各加入1ml重选后的液体，再加入4ml完全培养基，盖好瓶盖，“十”字摇匀，避免培养基接触瓶口，在瓶身上标记好细胞名词、时间、实验人员名称。

吴封菲 南方医科大学南方医院

我接触比较多的细胞是人肠系膜脂肪来源间充质干细胞，自己收集标本提取原代，一开始周围的人都说很难，可自己摸索以后，觉得这种细胞很好养~但在原代提取过程中也遇到了问题，一开始是按照文献自己配置的培养基，提取几次都失败了，研磨以后可以看到大量的细胞，可细胞就是不贴壁，直到换用了赛业的培养基才成功提取，现在回想，如果一开始就用的话，可以节省不少时间精力以及珍贵的标本。

除了以上获奖的，另一些英雄的肺腑之言也非常形象：

“养细胞就像养孩子，最重要的是放养，不要太care，老是去动，放在那，养2天，瞅一瞅……”

再次感谢各路大侠鼎力相助。科研修炼并非神乎其神，望各位习得章法融会贯通，细胞江湖终会任你驰骋……