我如何把iPSC复苏存活率从50%拉到90%↑↑无私公开「避坑指南+标准操作流程」
对珍贵的iPSC细胞来说，复苏环节的微小失误，轻则导致细胞状态下滑，重则全军覆没！
赛业生物带你持续攻克iPSC细胞培养及应用，本文直击实验室最容易忽略的关键细节，用实战经验助你复苏存活率突破90%！
1. 复苏操作时间，直接决定细胞复苏后状态
从液氮中取出来的细胞到达水浴锅时间超1min！
正确操作：
-
将iPSC细胞从液氮罐中取出。
-
用镊子夹住冻存管，倒置2-3秒空出管盖残余液氮（这一步，是出于安全考量下的操作哦）。
-
步骤2也可以将iPSC细胞暂放入-80冰箱或者干冰中，使得残余液氮蒸发（切记！这一步一定不能拉长时间）。
-
最后用镊子夹住冻存管进行37℃水浴：快速摇晃至仅剩米粒大冰晶时立即取出（注意，尽量不要让水面没过管盖，防止细胞污染)。
图1. 慢冻快融和快冻慢融下冰晶形成和状态变化
2. DMSO解毒期
-
将解冻后的iPSC细胞悬液转移至15mL离心管中。
-
用移液管向管内逐滴滴加3mL完全培养基，注意每滴加完1mL晃动管身，充分混匀。
-
然后缓慢加入6mL完全培养基，盖好管盖，上下颠倒混匀。
-
180×g条件下离心5min。
3. 细胞铺板密度
经典错误：按常规细胞密度（1×10⁵/cm²）铺板
后果：iPSC细胞因缺乏细胞间信号传递，自发分化率飙升！
精准密度公式：
最佳铺板细胞数=（0.3×104）/（存活率%) × 培养面积(cm²)
示例：
35mm培养皿（面积≈9cm²），存活率80%时：
→铺板细胞数= (0.3×104/0.8)×9 =3.375×10⁵
即需要接种的细胞悬液体积（μL）=铺板细胞数/总细胞密度
图2. 不同接种密度下细胞克隆形成大小和致密度
4. 培养基的“隐形杀手”寒冷应激
经典错误：按常规将培养基恢复至室温后直接接种。
正确操作：
1. 刚复苏的细胞十分脆弱，接种时的培养基温度至关重要。
2. 包被后复温完成的孔板，吸走包被液，加入iPSC完全培养基，放入培养箱预热至少10min（需在细胞复苏操作前提前完成哦）。
3. 将细胞悬液接种到37℃复温完成后的培养基中。
5. 复苏后关键检测指标
|
检测时间 |
关键指标 |
合格标准 |
检测工具 |
|
24小时 |
贴壁率 |
≥80% |
可以对上清中的细胞进行计数，计算真实贴壁率 |
|
48小时 |
OCT4/NANOG表达率 |
≥90% |
免疫荧光检测 |
异常处理方案：
-
复苏当天活率<60% →细胞接种时向培养基中添加10μM ROCK抑制剂（Y-27632）。
-
自发分化灶出现 → 局部机械法剔除。
填写需求描述给我们
工具快速咨询
400-680-8038
info@oricellbio.cn
在线咨询
电话咨询
