01 iPSC分化预警：这些细胞形态变化在"说话"

中胚层分化细胞形态图

外胚层分化细胞形态图

iPSC细胞极易分化，可能是受到以下方面的影响：

过于致密造成细胞堆积

单个细胞克隆较大。iPSC没有生长抑制，克隆中间的细胞无限生长会造成堆积，细胞致密堆积是外胚层分化的重要条件之一，在这样的环境下细胞易自发向外胚层分化。

因子作用不平衡

iPSC的自我更新与干性维持需要多重因子共同作用维持平衡状态，一旦某个方向“用力过度”或“力量不足”，就会破坏这种平衡，导致分化。iPSC向不同方向的分化可以通过基因分析判定，哪个胚层的基因高表达，表明此时的iPSC朝哪个方向分化，可以针对性抑制相关分化或回溯失去平衡的原因进行补足（如图3所示），我们可以以此来维持iPSC的未分化状态。

iPSC自我更新相关机制^[1]

研究对以上两种细胞进行分析，对“甜甜圈”内部和外部细胞进行qPCR，发现内部细胞高水平表达外胚层相关基因，预示着其向外胚层方向分化（如图4所示）。

“甜甜圈”内外部细胞qPCR结果展示图^[1]

对边缘分化细胞和克隆内部细胞进行qPCR分析，发现边缘分化细胞高水平表达中胚层相关基因，预示这其向中胚层方向分化（如图5所示）。

边缘分化细胞与中心细胞qPCR结果展示图^[1]

在iPSC细胞培养中出现分化时，可以采取以下几种方法来解决问题：

局部"手术"：

用10μL移液枪头刮除分化区域（适用于<20%分化率）。

整体"给药"：

一对一针对性“治疗”，发现出现外胚层分化趋势后首先剔除分化团块，后续可以考虑在维持培养基中添加少量Dorsomorphin。研究表明添加一定量Dorsomorphin后可降低细胞外胚层分化标志物表达水平^[1]。出现类似中胚层分化趋势后可加入少量IWP2来抑制其进一步分化。

控神器：每天镜下观察克隆形态，发现异常立即处理。

传代优化：采用克隆团传代，接种后显微镜下观察，若整体克隆团块过大，整体轻微吹打两下，若单个克隆团块过大，可吸出舍弃或吸出后转至洁净EP管中针对性吹打。

培养升级：使用高质量的iPSC专用培养基，如赛业OriCell^®自主研发的「人诱导多能干细胞完全培养基」（货号HUIPS-90011），其优化了营养成分和生长因子，让iPSC更好地维持未分化状态。

当然啦，市面的各款iPSC维持培养基在研发过程中就充分测试并考虑到各个方向分化问题，其体系是刚好维持iPSC未分化的平衡状态，自己添加新试剂进去的时候一定要慎重做好备份。

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参考文献：

[1] Frank S, Zhang M, Schöler HR, Greber B. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PLoS One. 2012;7(7):e41958. doi: 10.1371/journal.pone.0041958. Epub 2012 Jul 30.