让细胞发光！揭秘慢病毒如何给间充质干细胞装上‘GPS’！

原理超简版

① 慢病毒：基因的“快递员”
• 改造后的慢病毒“无害化”，却能高效将GFP基因“送货上门”，整合到细胞基因组，实现长期稳定发光！
• 搭配Polybrene“助攻神器”，轻松感染难转染的BMSCs！

② GFP：细胞的“荧光身份证”
• 无需染色、实时观察！荧光显微镜下，干细胞变身“小绿灯”，分化、迁移一目了然！

贴壁细胞慢病毒转导实验方法

材料准备：
• OriCell®成人骨髓间充质干细胞（货号HUXMA-01001）
• OriCell®成人骨髓间充质干细胞完全培养基（货号HUXMA-90011）
• OriCell®带有绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒（货号LVRN-10011）
• OriCell®Puromycin (10mg/mL)（货号PUAT-10001）
• OriCell®人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化试剂盒（货号HUXMX-90021）
• OriCell®人骨髓间充质干细胞成脂诱导分化试剂盒（货号HUXMX-90031）
• OriCell®人骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒（货号HUXMX-90041）

Day 0
准备细胞
1. 细胞消化、离心收集。
2. 根据细胞生长特性，接种至合适的培养板中（建议使用24孔板、12孔板、6孔板）。
3. 接种细胞的量以24~48h后汇合度达到50%~70%左右为宜。

Day 1
病毒投递
1. 从-80℃冰箱中取出慢病毒，放入4℃冰箱或冰盒中解冻，备用。
2. 预热细胞培养基。
3. 给所有需要转染病毒的细胞更换新鲜的培养基（24孔板每孔300~500μL，12孔板每孔400~800μL，6孔板每孔1~1.2mL）。
4. 根据细胞适宜的MOI及病毒滴度，加入相应体积的病毒悬液。计算公式：病毒体积＝（MOI×细胞数量）/病毒滴度。
5. Polybrene能提高慢病毒转导效率，它是多聚阳离子，通过正电荷中和帮病毒突破细胞膜防线。但Polybrene对某些细胞有毒性。❗❗如果使用Polybrene，应先选几个工作浓度（1-10ug/mL）测试Polybrene对靶细胞的毒性，一般情况，5ug/mL的Polybrene适合较多细胞。
6. 轻柔并充分混匀病毒悬液、Polybrene以及培养基，将细胞放回37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
7. 6~8h后观察细胞状态，若发现形态变化或其他明前异常，则需更换新鲜无病毒的培养基；若无异常，可继续培养过夜后更换新鲜培养基，以保证足够的转染时间。

Day 3~5
观察、药筛
1. 转染过慢病毒的细胞，一般可在24h观察到绿色荧光的表达，在48~72h之间表达量至峰值。
2. 观察细胞的荧光率和表达强度，在转染48h后即可开始药筛（OriCell®慢病毒产品已携带嘌呤霉素puromycin抗性基因）。
3. 每2~3天更换一次含有嘌呤霉素的完全培养基，直到细胞的荧光率达到需要。

注意！
• 请在观察到有明显绿色荧光表达后开始药筛。
• 各种细胞适合的药筛浓度可能有较大差异，请做好充分测试。
• 请做好野生型药筛对照，原则上需要加药培养至野生型细胞全部死亡，但部分细胞可能较脆弱，细胞状态明显变差时，请及时停止药筛。
• 一般嘌呤霉素药效峰值在48~72h。

结果验证

荧光显微镜：视野一片绿光，成就感拉满！