软骨细胞实验特辑：如何原代分离提取软骨细胞
软骨组织由软骨细胞、基质及纤维构成。软骨组织再生能力强，这些增生的幼稚细胞形似纤维母细胞，以后逐渐变为软骨母细胞，并形成软骨基质，细胞被埋在软骨陷窝内而变为静止的软骨细胞。软骨细胞位于软骨陷窝内。
幼稚的软骨细胞位于软骨组织的表层，单个分布，体积较小，呈椭圆形，长轴与软骨表面平行，越向深层的软骨细胞体积之间增大呈圆形，细胞核圆形或卵圆形，染色浅，细胞质弱嗜碱性，常见数量不一的脂滴。
新生动物软骨细胞在提取时具有高活性、高提取效率、细胞质量好等优势，赛业OriCell®软骨细胞分离自软骨组织，采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化的方法分离纯化获得。体外培养的软骨细胞对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具重要意义。本文就为大家重点介绍如何原代分离提取软骨细胞。
软骨细胞分离提取步骤
实验材料：乳鼠出生7d以内。
实验试剂：OriCell®软骨细胞完全培养基、OriCell®0.1% I型胶原蛋白酶、OriCell®0.25%中性蛋白酶、OriCell®PBS 100mL。
实验耗材：10cm培养皿、6cm培养皿、眼科镊（4把）、眼科剪（2把）、一次性吸管、无菌解剖盘。
实验步骤：
1. CO2窒息处死小鼠，75%酒精浸泡2-3 min。
2. 在超净台内将小鼠的后肢完整取下，放入含有2%双抗的PBS培养皿中，清洗去除表面血液和杂质。
3. 使用干净的眼科镊和眼科剪将股骨和胫骨上的肌肉组织剔除，保留两端软骨的完整性。
4. 将关节处软骨从骨头上分离下来，将软骨上附着的肌肉和筋膜剔除干净。
5. 收集于6cm培养皿内，用眼科剪将组织剪碎至0.5mm³，太大酶解不彻底，太小损伤细胞。
6. 加入I型胶原酶和中性蛋白酶混合液，放入37℃培养箱内，消化6-8h，每隔1-2h取出培养皿，用一次性吸管吹打促进组织消化。
7. 消化结束后，用软骨完全培养基终止消化，进行离心。
8. 离心（300g、5min），弃上清，沉淀用PBS重悬再次离心，防止酶残留，影响细胞贴壁。
9. 细胞沉淀用软骨专用完全培养基重悬接种，将接种的培养皿放入37℃、5% CO2相对湿度的培养箱中培养。
10.次日观察细胞，是否有较多细胞碎片和死细胞，可以酌情考虑半量换液或全换液。
11.48h后细胞汇合度就能达到90%，细胞立体透亮、形态呈梭形、多角形，可以按照1:3的比例进行传代。
细胞形态：
培养条件优化Tips：使用高浓度血清的培养基（如10%胎牛血清+营养因子）进行细胞培养，有助于细胞的贴壁和增殖。
OriCell®软骨细胞完全培养基包含适合原代软骨细胞生长的基础培养基、OriCell®优级胎牛血清及细胞生长所需的其他添加物，可长期维持原代软骨细胞在体外良好的生长状态。
细胞检测（OriCell®软骨细胞质控要点）：
1. 细胞鉴定：免疫荧光检测Collagen II为阳性＞90%。
2. 通过细菌、真菌、支原体、内毒素检测。
3. 通过细胞复苏活力检测，复苏存活率>90%。
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