骨髓间充质干细胞是什么?如何获取?
BMSC起源与妙用
干细胞家族最著名的老祖宗就是胚胎干细胞了。
胚胎干细胞是在受精卵持续的卵裂( cleavage),从2细胞-4细胞-8细胞-16个细胞的实心细胞团桑葚胚( modula),接着到了囊胚阶段,桑葚胚继续发育成为一个囊胚,外层发育出一层单层细胞成为滋养层细胞后期发育为胎膜和胎盘,其内部充满液体的囊胚腔,还有一团未分化的细胞,这团细胞就是胚胎干细胞了!胚胎干细胞接着继续发育成内、中、外三个胚层,间充质干细胞即起源于中胚层。
来源于骨髓组织的间充质干细胞,能够分化为骨骼、软骨、脂肪、骨髓造血组织等,还有很多优点,如可以对造血干细胞给予支持,还能分泌多种生长因子,IL-6,IL-11,LIF,M-CSF及SCF等来促进造血;还有抗纤维化作用,促进组织血管存活,动员内在祖细胞增殖分化,同时自身也分化成组织细胞;促进血管新生;免疫调节作用,抗炎,还可用于自身免疫性疾病的治疗,小小的细胞大大的用途呀!
BMSC分离培养
既然骨髓间充质干细胞这么神奇,那如何可以获取它呢?以下以人源的骨髓间充质干细胞的密度梯度离心法为例,讲解一种实用的实验方法。
材料准备
样本:骨髓10mL。
试剂:
商品化密度为1.077g/cm3淋巴细胞分离液;
OriCell®PBS缓冲液;
OriCell®成人骨髓间充质干细胞完全培养基。
耗材:50mL离心管5-10个;10mL移液管4个;T75培养瓶1个。
原代分离
1. 将骨髓加入一只50mL离心管中,500g离心30分钟,离心机设置升速7降速0。
注意:降速设置为0的目的是为了离心后血浆层和细胞层分层更清晰。
2. 离心完毕,离心管中出现分层现象:上层是血浆,下层是各种细胞集合。小心用移液管将血浆转移出去,剩余的细胞加入PBS定容至10mL,用移液管充分并轻柔的混匀,铺到已加入10mL淋巴细胞分离液上。
注意:铺的过程一定要让稀释后骨髓细胞稀释液非常缓慢的接触到分离液的液面,尽量避免电动移液枪放速过快使骨髓细胞稀释液冲入分离液液面,如果出现此情况会严重影响密度梯度分离的效果,铺的过程完成后将离心管轻拿轻放转移到离心机吊篮中,600g离心30分钟。
3. 离心完成后会出现下图的分层情况,一共有4层,从上到下每层的成分分别为血浆和血小板,环状乳白色白膜层,此层成分为单核细胞和淋巴细胞,就是我们要的,然后是透明分离液,中性粒细胞,红细胞。
密度梯度离心法分离BMSC
4. 吸取白膜层。
注意:吸取过程为先吸掉最上层,吸到距离白膜层2-3毫米处停止,接下来吸取一直到距离白膜层下方2-3毫米处停止,将吸取到的转移到一个新的离心管中,600g离心10分钟。
吸取白膜层手法推荐:将移液管抵在离心管壁转圈沿管壁吸取,这样能减少白膜层细胞粘到离心管壁造成细胞损失。
5. 离心完成后去掉上清液,加入10mLPBS充分轻柔吹打混匀,600g离心10分钟,此步骤重复一次。
传代培养
最后一次离心完后,去掉上清液加入OriCell®成人骨髓间充质干细胞完全培养基,轻柔吹打混匀,按1.5×106个细胞/cm2接种到1个T75培养瓶中,轻轻混匀后放入5%CO2细胞培养箱培养,72小时后全换液,轻轻晃动去除未贴壁杂细胞及死细胞,之后每三天一次全换液,细胞融合度80%时可以进行传代培养。
传代可以使用细胞刮刀或者0.25%胰蛋白酶室温消化1分钟,每次传代接种密度控制在8000-10000个细胞/cm2。后续可以根据自己的实验需求传代或者冻存。
以上就是人的骨髓间充质干细胞的密度梯度分离法详解,此外,还有比如小动物的股骨和胫骨取骨髓直接贴壁法,用不同类型的分离液的其他密度梯度分离法等等,供大家选择。希望这篇文章对您有所帮助。
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