为了深入了解干细胞治疗缺血性心脏病的机制，阿拉巴马大学伯明翰分校领导的研究团队原位鉴定了缺血心脏中间充质干细胞（MSC）的蛋白质组，未来也许有助于心脏修复。这项成果已发表在《Theranostics》杂志上。

缺血性心脏病及其引起的心力衰竭仍然是全球头号杀手。再生医学疗法，如细胞治疗，展现出良好的治疗前景。成体MSC因易分离、免疫原性低且具有再生潜能等优势备受关注，然而，多项临床试验的结果却不如预期，部分原因在于我们对其生物学机制的了解还很有限。

人们认为，MSC主要通过分泌生物活性分子和微泡来促进组织修复，给药细胞如何适应不利的组织环境，以及它们在局部产生了哪些因子，在很大程度上仍是未知的。以往的大多数MSC分泌组研究是在细胞培养物中进行的，未必能代表它们在体内的真实状况。由于目前研究还缺乏一种以细胞类型特异性的方式来分析整体的蛋白质表达的技术，因此人们对缺血性心脏中的MSC蛋白质组知之甚少，无法推测其潜在的修复活性。

直到近几年，科学家成功实现了细胞类型特异性标记和新生蛋白质组的分离。他们用突变的甲硫氨酰tRNA合成酶（MetRS）来靶向特定细胞，将甲硫氨酸替代物叠氮基亮氨酸（ANL）掺入新合成的多肽中，然后再通过点击反应（click reaction）来进行可视化或后续的分离和鉴定。而之前发现，带有L274G突变的MetRS特别适合哺乳动物细胞，并允许ANL结合到甲硫氨酸所在的N端和内部位点。

为此，研究人员将MetRS^L274G引入MSC中，然后将转导的细胞注射到心肌梗死（MI）小鼠缺血心肌中，再通过液相色谱/质谱（LC/MS）和生物信息学分析来定量新生的MSC蛋白质组（图1）。

图1. 研究实验流程

研究人员从赛业OriCell^®购得了C57BL/6 Mouse BMSCs。为了在MSC中实现非经典氨基酸标记，他们生成了MetRS^L274G-mCherry慢病毒载体，这种载体的感染会导致大多数MSC表达红色荧光蛋白（mCherry），有利于筛选稳定转导的细胞。之后用ANL处理细胞，使其掺入新合成的蛋白质中，接着裂解细胞进行click-iT反应（图2）。

在铜离子的催化下，ANL标记的蛋白能够与包含炔基的染料发生反应，从而通过生物正交非经典氨基酸标记（BONCAT）或荧光非经典氨基酸标记（FUNCAT）进行可视化，也可以与包含炔基的树脂发生反应，实现分离/富集和质谱鉴定。他们发现，通过这种方法，ANL标记的蛋白能够被灵敏而特异地检测到。

图2. MSC的蛋白质组标记策略

为了研究MSC蛋白质组在缺血和正常心脏中的动态表达，他们将MetRS^L274G转导的MSC注射到心肌梗死小鼠的梗死边缘区或假手术小鼠的相关区域，然后在不同时间点腹腔注射ANL。在植入MSC的细胞中，MetRS^L274G的表达产生了强烈的FUNCAT信号，表明细胞存在新生的ANL标记蛋白。相比之下，对照病毒转导的MSC则没有标记任何蛋白质，说明这种标记方法在体内具有较高的灵敏度和选择性。

在注射细胞后第1、3和7天，研究人员通过点击反应从左心室细胞裂解液中分离出MSC蛋白质组，并通过LC/MS进行鉴定。在总共6个组（心肌梗死组和假手术组，各三个时间点）中，648种蛋白质是共有的，占每组总蛋白质的82±5%。尽管存在大量共同的表达模式，但他们发现心肌梗死组和假手术组的蛋白质组仍然能够很好地区分。

为了鉴定缺血和正常心脏中差异表达的MSC蛋白，他们通过火山图比较了两者之间的差异。有意思的是，在第1、3和7天，与对照相比，缺血心脏分别有26、110和65种蛋白质显著上调，而有11、28和19种蛋白质显著下调。通过GO富集分析，他们发现差异主要集中在细胞外基质结构、应激反应和凋亡过程调节中，这可能反映了MSC如何对缺血和缺氧的心肌环境做出反应并发挥其修复心脏的作用（图3）。

图3. 对缺血心脏和对照心脏中MSC的差异表达蛋白进行鉴定

具体来说，从第1天到第3天，缺血心脏中的细丝蛋白A增加了12倍，显著高于对照。心肌梗死组丝切蛋白和纤连蛋白的检测水平也高于假手术组。这些数据表明，MSC对缺血心脏的作用可能主要归因于它们产生细胞外基质。此外，许多损伤相关分子模式（DAMP）也出现上调，包括热休克蛋白、S100A9蛋白、HMGB2和补体因子H，表明MSC参与了炎症调节。

为了更好地了解缺血心肌中MSC的功能状态，研究人员开展了KEGG通路分析。他们发现，与对照相比，与补体和凝血级联反应、肌动蛋白细胞骨架调节和细胞凋亡相关的通路和蛋白质在缺血心脏中高度富集，这说明了MSC蛋白质组和分泌组可能是治疗心脏缺血的宝贵资源。

研究人员认为，基于非天然氨基酸的蛋白质生物正交标记是一种强大的工具，能够对体内的动态蛋白质组进行整体分析。这种方法有助于人们实时了解MSC的适应性和修复作用。